不做测序的m6a高性价比研究套路

m6A修饰几乎涉及RNA代谢的所有方面,成为近期大热的研究领域。那么如何将我们的自身研究与m6A进行相关联,有哪些可以借鉴的低成本套路?今天小编推出的这篇文章是近期发表在environment research (IF= 5.2) 上关于环境毒物对m6A修饰影响的一篇文章,主题是暴露于环境毒物中可减少整体N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)RNA甲基化并改变RNA甲基化调节基因的表达,题目如下:

RNA表观遗传组是指信使RNA (mRNA),核糖体RNA(rRNA),转移RNA(tRNA)和小型核仁RNA(snoRNA)的修饰。自1957年首次发现以来,有100多种不同的RNA修饰在一系列生物中已有报道。m6A修饰是最常见的RNA甲基化形式,占所有RNA修饰的80%以上。此修饰参与转录的稳定性,剪接,导出和翻译的调节,进而参与组织发育,昼夜节律和DNA损伤反应的控制,并在胚胎干细胞维持中起重要的调控作用,近年来研究热度很高。
但是,迄今为止,尚未有关于RNA表观遗传标记是否可以通过环境有毒物质的影响而进行修饰的研究。作者提出m6A在组织发育及其在癌症中的作用可能暗示了环境有毒物质可能通过氧化应激相关途径改变了RNA甲基化调节剂的表达。在该研究中,作者从不同处理对m6A水平变化入手,探讨了环境毒物对m6A RNA修饰和m6A调节基因(writer, erasers, readers)表达水平的影响,同时,分析了暴露于两种致癌物(PM和亚砷酸钠)和两种内分泌干扰物(BPA和vinclozolin)后人肺上皮细胞中m6A RNA甲基化水平的变化。

接下来,小编带大家详细了解一下本研究的方法和获得的结果

暴露于致癌物和内分泌干扰物后m6A RNA甲基化的改变
在暴露于PM(0–500μg / ml)和亚砷酸钠(0–50μM)中24h和48h后, 研究测量了A549细胞中总体m6ARNA甲基化水平。当暴露于浓度>62μg/ ml的PM中,会引起m6A甲基化的显著变化(从100%降至46%(62μg/ ml)至31%(500μg/ ml)之间, 图1A)。同样,暴露于62、125、250和500μg/ ml浓度的 PM中48h,m6A甲基化显著下降。其中,暴露24h,m6A水平与PM浓度呈显著的负相关(R 2 = -0.56, p <0.05)。暴露48h,未观察到剂量效应(p> 0.05)。暴露于浓度> 2.5μM的亚砷酸钠24h可使m6A甲基化水平显著降低至正常水平的58%(2.5μM亚砷酸钠环境)和23%(10μM亚砷酸钠环境)之间(图1B)。暴露于1.0、2.5、10和50μM亚砷酸钠48小时后,m6A水平显著降低至正常水平的25–36%。线性回归分析结果表明,m6A水平没有呈现剂量依赖性的降低(p> 0.05)。
在分别暴露于0-50μM和0-100μM的BPA和Vinclozolin 24h后,研究测量了A549细胞的总体m6ARNA甲基化水平。当暴露于>0.1μMBPA中时,会导致m6A甲基化水平显著降低(图1C)。同样,在所有浓度(0.1–100μM)下暴露于Vinclozolin导致m6A甲基化水平显著降低(图1D)。 


 
暴露于致癌物和内分泌干扰物后的细胞活力变化

 

随着所用毒物浓度的降低,细胞活力仍然很高,但在最高暴露水平下却大大降低了。PM暴露24h和48h的水平与细胞活力呈负相关(r = -0.98,p = 0.005和r=-1.0,p=0.0001)(图2A)。同样,暴露于亚砷酸钠的浓度水平也与细胞在24h(r=-0.94,p=0.005)和48 h(r=0.94,p=0.005)时的生存能力呈负相关(图2B)。细胞活力与BPA(r=-1.0,p=0.01)和vinclozolin(r =-1.0,p=0.01)水平在24h时同样呈现负相关关系(图2C和D)。

PM暴露下RNA甲基化调节剂基因表达的变化
该研究同时在一个公开的数据集中分析了RNA甲基化调节基因的表达。该研究的数据是基于慢性PM暴露研究的基因表达微阵列数据(GSE60767)。基因表达的微阵列数据中,高暴露组的个人PM 2.5暴露水平为6.0至119.0μg/ m3,而对照组为7.6至55.1μg/ m3。为了检查肺恶性肿瘤中的相同基因,作者利用了来自肺腺癌(LUAD),鳞状细胞癌(LUSC)和来自癌症基因组图谱(TCGA)的正常肺上皮组织和基因型组织表达(GTEx)的公开基因表达数据。总共分析了483个LUAD样本,347个LUAD配对的邻近正常组织,486个LUSC样本和338个LUSC配对的邻近正常组织。
统计分析结果表明,与对照组相比,高PM 2.5组的METTL3和WTAP的表达水平分别升高1.27倍和2.11倍(METTL3,p <0.05;WTAP,p <0.01;图3A和B)。同样,在高PM2.5中,与对照组相比, FTO和ALKBH5的表达水平分别高1.31和1.29倍(FTO p<0.05,ALKBH5 p<0.001;图3C和D),而高PM 2.5组HNRNPC的表达高1.52倍(p<0.05;图 3E)。但是, METTL14和KIAA1429的表达在两组之间没有显著差异。



RNA甲基化调节基因在肺癌患者中的表达
为了研究与PM暴露相关的m6A RNA甲基化和RNA甲基化调节剂基因表达变化与恶性肿瘤发展的相关性,作者分析了可公开获得的LUAD和LUSC表达微阵列数据集中RNA甲基化writers, erasers 和readers的表达。分析表明,LUAD患者(n=483)中m6A writer METTL3的表达比正常肺组织(n=347)低2.1倍(图4A)。在LUSC患者中(n = 486),METTL3表达比正常肺组织(n=338)低2.4倍(ANOVA,p <0.0001)(图4B)。除METTL3以外,与正常组织相比,在LUAD或LUSC中没有发现其他m6A RNA甲基化调节基因的表达有明显不同。

总之,该研究表明,暴露于致癌物和内分泌干扰物化学物质可修饰m6A RNA甲基化。此外,暴露于颗粒物质与m6A RNA甲基化机制的差异表达有关,这对m6A改变的机制的深入了解提供了可能。
本研究首先从细胞水平上鉴定了环境毒物对m6A RNA甲基化及细胞活力的影响。同时,基于一项已发表的慢性PM暴露研究的基因表达微阵列数据,探讨了环境毒物对m6A RNA修饰和m6A调节基因表达水平的影响。目前,通过m6A甲基化测序构建疾病细胞模型或者发病组织的m6A修饰谱是m6A研究的主要方向。本研究为大家提供了另外一个“不做测序的m6a高性价比研究套路”,供大家参考。m6A 修饰的相关研究刚刚起步,还留有很多空白值得我们去探索。

 

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